កម្រិតនៃភាពបរិសុទ្ធនៃប្រូតេអ៊ីនដែលត្រូវការគឺអាស្រ័យលើការប្រើប្រាស់ប្រូតេអ៊ីនចុងបញ្ចប់។
ចំពោះកម្មវិធីមួយចំនួនការដកស្រង់ឆៅគឺគ្រប់គ្រាន់។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយសម្រាប់ការប្រើប្រាស់ផ្សេងទៀតដូចជាអាហារនិងឱសថកម្រិតខ្ពស់នៃភាពបរិសុទ្ធត្រូវបានទាមទារ។ ដើម្បីសម្រេចបាននូវវិធីសាស្រ្តបន្សុតប្រូតេអ៊ីននេះត្រូវបានគេប្រើជាទូទៅនៅក្នុងស៊េរីនៃជំហានបន្សុត។
ជំហានបន្សុតប្រូតេអ៊ីននីមួយៗជាធម្មតាធ្វើឱ្យបាត់បង់ផលិតផល។ ដូច្នេះយុទ្ធសាស្រ្តប្ប្រូតេអ៊ីនដ៏ល្អបំផុតគឺមួយដែលកម្រិតខ្ពស់បំផុតនៃការបន្សុតត្រូវបានឈានដល់ជំហានតូចបំផុត។ ការជ្រើសរើសជំហានដែលត្រូវប្រើគឺពឹងផ្អែកទៅលើទំហំការបន្ទុករលាយនិងលក្ខណៈផ្សេងទៀតនៃប្រូតេអ៊ីនគោលដៅ។ បច្ចេកទេសដូចខាងក្រោមនេះមានភាពសមស្របបំផុតសម្រាប់ការសម្អាតជាតិប្រូតេអ៊ីនស៊ីតូស៊ីល។ ការលាងសម្អាតនៃប្រូតេអ៊ីនអ៊ីនធូស្យូមមានភាពស្មុគស្មាញហើយជាទូទៅតម្រូវឱ្យមានវិធីសាស្ត្រផ្សេងៗគ្នា។
ជំហានដំបូងសម្រាប់ការបោសសម្អាតប្រូតេអ៊ីន
ជំហានដំបូងក្នុងការសម្អាតជាតិប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងកោសិកាគឺជាការរៀបចំ សារធាតុចម្រាញ់ឆៅ ។
ការដកស្រង់នឹងមានល្បាយប្រូតេអ៊ីនទាំងអស់ពីកោសិកាប្លែកៗនៃកោសិកានិងម៉ូលេគុលមីកូលូលិកបន្ថែមនិងសារធាតុចិញ្ចឹមមួយចំនួន។ ការដកស្រង់ឆៅអាចត្រូវបានប្រើសម្រាប់កម្មវិធីមួយចំនួននៅក្នុងបច្ចេកវិទ្យាជីវសាស្រ្តបើទោះជាភាពបរិសុទ្ធគឺជាបញ្ហាមួយជំហានបន្ទាប់បន្សុទ្ធកម្មត្រូវតែអនុវត្តតាម។
សារធាតុប្រូតេអ៊ីនឆៅត្រូវបានរៀបចំដោយការយកចេញនៃកំទេចកំទីកោសិកាដែលបង្កើតឡើងដោយកោសិកាអ៊ីសនីសដែលត្រូវបានសម្រេចដោយប្រើសារធាតុគីមីនិង អង់ស៊ីម អេឡិចត្រូនិចឬសារពត៌មានបារាំង។ កំទេចកំទីកំទេចកំទីត្រូវបានយកចេញដោយការកណ្តាលផ្តាសាយនិងពន្យាកំណើតត្រូវបានរកឃើញវិញ។ ការរៀបចំប្រេងឆៅនៃប្រូតេអ៊ីន extracellular អាចត្រូវបានទទួលដោយគ្រាន់តែយកកោសិកាដោយ centrifugation ។
ចំពោះកម្មវិធី ជីវបច្ចេកវិទ្យា មួយចំនួនមានតម្រូវការ អង់ស៊ីមខ្ពស់បំផុត គឺអង់ស៊ីមដែលអាចអត់ធ្មត់លើសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ដោយគ្មានការបម្លែងនិងរក្សាសកម្មភាពជាក់លាក់ខ្ពស់។ សរីរាង្គដែលបង្កើតវាត្រូវបានគេហៅថា sometimes extremophiles ។ វិធីសាស្រ្តងាយស្រួលក្នុងការសំអាតប្រូតេអ៊ីនកំដៅធន់នឹងកំដៅប្រូតេអ៊ីនដទៃទៀតនៅក្នុងល្បាយដោយកំដៅបន្ទាប់មកត្រជាក់ដំណោះស្រាយ (ដូច្នេះហើយអាចឱ្យអង់ហ្ស៊ីមអាចធ្វើការកែទម្រង់ឬជួសជុលឡើងវិញប្រសិនបើចាំបាច់។
ដំណាក់កាលបោសសម្អាតកម្រិតមធ្យម
ក្នុងពេលកន្លងមកជំហានទីពីរជាទូទៅក្នុងការបន្សុទ្ធប្រូតេអ៊ីនពីសារធាតុចម្រាញ់ប្រេងឆៅមួយគឺដោយ របបទឹកភ្លៀង នៅក្នុងដំណោះស្រាយដែលមានកម្លាំងអូសស្តុតខ្ពស់ (ឧទាហរណ៍ដំណោះស្រាយអំបិល) ។ អាស៊ីត nucleic នៅក្នុងការដកស្រង់ឆៅអាចត្រូវបានយកចេញដោយសមាសធាតុ precipitating ដែលបានបង្កើតឡើងជាមួយ streptomycin sulfate ឬ protamine sulfate ។
ប្រូតេអ៊ីនជាធម្មតាត្រូវបានធ្វើដោយប្រើអំបិលអាម៉ូញ៉ូមជាអំបិល។
ប្រូតេអ៊ីនខុសៗគ្នានឹងធ្វើឱ្យប្រូតេអ៊ីន ស៊ុលម៉ុនស៊ុលហ្វ្រូសឡើងខ្ពស់ ។ ជាទូទៅប្រូតេអ៊ីននៃប្រូតេអ៊ីនទំងន់ម៉ូលេគុលខ្ពស់ក្នុងកំហាប់ទាបនៃអាម៉ូញ៉ូមស៊ុលហ្វាត។ ប្រូតុងអំបិលមិនសូវនាំទៅរកជាតិប្រូតេអ៊ីនខ្ពស់ទេប៉ុន្តែអាចជួយលុបបំបាត់ប្រូតេអ៊ីនដែលមិនត្រូវការមួយចំនួននៅក្នុងល្បាយនិងប្រមូលផ្ដុំគំរូ។ អំបិលក្នុងសូលុយស្យុងត្រូវបានយកចេញដោយការលាងសម្អាតតាមរយៈបំពង់ស្រទាប់ cellulose porous, filtration ឬ chromatography យកចេញជែល។
ពិធីការជីវសាស្រ្តសម័យថ្មីតែងតែឆ្លៀតយកប្រយោជន៍ពីឧបករណ៍ដែលអាចរកបានក្នុងពាណិជ្ជកម្មដែលផ្តល់នូវដំណោះស្រាយដែលត្រៀមរួចរាល់សម្រាប់នីតិវិធីស្តង់ដារ។ ការធ្វើពិសោធន៍ប្រូតេអ៊ីនជាញឹកញាប់ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើតម្រងនិងជួរដេកតម្រងជែលដែលបានរៀបចំ។ អ្វីដែលអ្នកត្រូវធ្វើគឺធ្វើតាមការណែនាំហើយបន្ថែមទំហំត្រឹមត្រូវនៃដំណោះស្រាយត្រឹមត្រូវហើយរង់ចាំរយៈពេលដែលបានបញ្ជាក់នៅពេលដែលប្រមូល eluant (អ្វីដែលចេញនៅចុងជួរឈរផ្សេងទៀត) នៅក្នុងបំពង់សាកល្បងថ្មី។
- វិធីសាស្រ្ត Chromatographic អាចត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើជួរឈរលេងជាកីឡាករបម្រុងកំពូលឬឧបករណ៍អេឡិចត្រូនិចដោយស្វ័យប្រវត្តិ។ ការបែងចែកដោយ HPLC អាចត្រូវបានធ្វើដោយវិធីផ្លាស់ប្តូរអ៊ីយ៉ុង, ការផ្លាស់ប្តូរអ៊ីយ៉ុងឬវិធីដកចេញទំហំនិងសំណាកដែលបានរកឃើញដោយអារេឌីយ៉ូទ័រឬបច្ចេកវិទ្យាឡាស៊ែរ។
ប្រូតេអ៊ីនការមើលឃើញនិងការវាយតំលៃនៃការបោសសម្អាត
- Chromatography បញ្ច្រាសដំណាក់កាល (RPC) បំបែកប្រូតេអ៊ីនដោយផ្អែកលើ ទឹកភ្លៀង របស់ពួកគេ។ បច្ចេកទេសនេះគឺជាការជ្រើសរើសខ្ពស់ប៉ុន្តែតម្រូវឱ្យមានការប្រើសារធាតុរំលាយសរីរាង្គ។ ប្រូតេអ៊ីនមួយចំនួនត្រូវបានបំលែងជាអចិន្ត្រៃដោយសារធាតុរំលាយហើយវានឹងបាត់បង់មុខងារក្នុងអំឡុងពេល RPC ។ ដូច្នេះវិធីសាស្រ្តនេះមិនត្រូវបានណែនាំសម្រាប់គ្រប់កម្មវិធីទាំងអស់ជាពិសេសប្រសិនបើវាចាំបាច់សម្រាប់ប្រូតេអ៊ីនគោលដៅដើម្បីរក្សាសកម្មភាព។
- ការផ្លាស់ប្តូរអ៊ីយ៉ុងការផ្លាស់ប្តូរ សំដៅទៅលើការបំបែកនៃប្រូតេអ៊ីនដោយផ្អែកលើ បន្ទុក ។ ជួរឈរអាចត្រូវបានរៀបចំសម្រាប់ការផ្លាស់ប្តូរសត្វអាកាសឬការផ្លាស់ប្តូរ cation ។ ជួរឈរ Anion ផ្លាស់ប្តូរ មានដំណាក់កាលស្ថេរភាពជាមួយនឹងបន្ទុកវិជ្ជមានដែលទាក់ទាញប្រូតេអ៊ីនបានគិតថ្លៃអវិជ្ជមាន។ ជួរឈរ ផ្លាស់ប្តូរ cation គឺផ្ទុយបញ្ច្រាសអេឡិចត្រូនិកអវិជ្ជមានដែលទាក់ទាញប្រូតេអ៊ីនដែលបានគិតថ្លៃជាវិជ្ជមាន។ ការបែងចែកប្រូតេអ៊ីនគោលដៅត្រូវបានធ្វើឡើងដោយការផ្លាស់ប្តូរ pH នៅក្នុងជួរឈរដែលជាលទ្ធផលនៃការផ្លាស់ប្តូរឬអព្យាក្រឹតនៃក្រុមមុខងារដែលបានចោទប្រកាន់នៃប្រូតេអ៊ីននីមួយៗ។
- ការច្រឹបយកចេញពីទំហំ ( ការ បំបែក ជែល ) បំបែកប្រូតេអ៊ីនធំ ៗ ពីតូចៗដោយសារម៉ូលេគុលធំធ្វើដំណើរលឿនតាមរយៈប៉ូលីម័រដែលភ្ជាប់ឆ្លងកាត់នៅក្នុងជួរឈរ Chromatography ។ ប្រូតេអ៊ីនធំមិនសមនឹងរន្ធនៃវត្ថុធាតុ polymer ទេចំណែកប្រូតេអ៊ីនតូចៗធ្វើនិងចំណាយពេលយូរដើម្បីធ្វើដំណើរតាមរយៈជួរឈរ Chromatography តាមរយៈផ្លូវតិចជាងដោយផ្ទាល់។ ថ្នាំ Eluate ត្រូវបានគេប្រមូលជាបំពង់ចម្រុះដែលបំបែកប្រូតេអ៊ីនដោយផ្អែកលើពេលវេលានៃការលាងសំអាត។ ការលាងជែលគឺជាឧបករណ៍មានប្រសិទ្ធភាពសម្រាប់ការប្រមូលផ្តុំសំណាកប្រូតេអ៊ីនមួយចាប់តាំងពីប្រូតេអ៊ីនគោលដៅត្រូវបានគេប្រមូលបានក្នុងបរិមាណតិចជាងការបូកបញ្ចូលទៅជួរដេក។ បច្ចេកទេសចម្រោះស្រដៀងគ្នានេះអាចត្រូវបានប្រើក្នុងកំឡុងពេលផលិតកម្មប្រូតេអ៊ីនខ្នាតធំដោយសារតែប្រសិទ្ធភាពចំណាយរបស់ពួកគេ។
- Chromatography ភាពអាស្រ័យ គឺជាបច្ចេកទេសដែលមានប្រយោជន៍ខ្លាំងណាស់សម្រាប់ "ប៉ូឡូញ" ឬបំពេញដំណើរការបន្សុតប្រូតេអ៊ីន។ Beads នៅក្នុងជួរឈរ Chromatography ត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ទៅនឹងតំណភ្ជាប់ដែលភ្ជាប់ទៅនឹងប្រូតេអ៊ីនគោលដៅ។ បន្ទាប់មកប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានយកចេញពីជួរឈរដោយលាងជាមួយនឹងដំណោះស្រាយដែលមានលីទីសេរី។ វិធីសាស្រ្តនេះផ្តល់នូវលទ្ធផលបរិសុទ្ធបំផុតនិងសកម្មភាពជាក់លាក់ខ្ពស់បំផុតបើប្រៀបធៀបទៅនឹងបច្ចេកទេសផ្សេងទៀត។
- SDS-PAGE គឺជាអេឡិចត្រូម៉ាសអេឡិចត្រូម៉ាសអេឡិចត្រូម៉ាសអេហ្វ័រអេហ្វអូអេសអេហ្វអេលអេហ្វអេសអេហ្វអេសអេហ្វអេលអេហ្វអេលអេលអេហ្វអេសអេហ្វអេលអេលអេហ្វអេសអេហ្វអេលអេលអេហ្វអេលអេលអេលអេហ្វអេលអេលអេលអេហ្វអេលអេលអេលអេហ្វអេលអេលអេលអេហ្វអេល។ ដោយសារការចោទប្រកាន់នៃប្រូតេអ៊ីនទាំងអស់ស្មើគ្នាស្មើគ្នាវិធីសាស្ត្រនេះបំបែកវាស្ទើរតែទាំងស្រុងដោយផ្អែកលើទំហំ។ SDS-PAGE ត្រូវបានប្រើដើម្បីពិសោធន៍ភាពបរិសុទ្ធនៃប្រូតេអ៊ីនបន្ទាប់ពីជំហាននីមួយៗក្នុងស៊េរី។ ក្នុងនាមជាប្រូតេអ៊ីនដែលមិនចង់បានត្រូវបានយកចេញបន្តិចម្តង ៗ ពីល្បាយចំនួនក្រុមដែលត្រូវបានមើលឃើញនៅលើជែល SDS-PAGE ត្រូវបានកាត់បន្ថយរហូតដល់មានតង់តែមួយដែលតំណាងឱ្យប្រូតេអ៊ីនដែលចង់បាន។
- Immunoblotting គឺជាបច្ចេកទេសមើលឃើញប្រូតេអ៊ីនដែលត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុងការរួមបញ្ចូលគ្នាជាមួយ chromatography ភជៈ។ អង់ទីករសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីនជាក់លាក់មួយត្រូវបានប្រើជា ligands នៅលើជួរ Chromatography ភាពស្រដៀងគ្នាមួយ។ ប្រូតេអ៊ីនគោលដៅត្រូវបានរក្សាទុកនៅលើជួរឈរបន្ទាប់មកយកចេញដោយការលាងសម្អាតជួរឈរជាមួយដំណោះស្រាយអំបិលឬភ្នាក់ងារផ្សេងទៀត។ អង់ទីប៊ីយោទិចដែលមានទំនាក់ទំនងទៅនឹងជំនួយវិទ្យុសកម្មឬថ្នាំពណ៌ក្នុងការរកឃើញនៃប្រូតេអ៊ីនគោលដៅនៅពេលវាត្រូវបានបំបែកពីល្បាយដែលនៅសល់។
ប្រភព:
Zubay G. 1988. ជីវគីមីវិទ្យា, បោះពុម្ពលើកទី 2 ។ ក្រុមហ៊ុនបោះពុម្ពម៉ាកមីលឡានញូវយ៉កក្រុងញូយ៉កសហរដ្ឋអាមេរិក។
ក្រុមហ៊ុន Amersham Pharmacia Biotech ។ ឆ្នាំ 1999 ។ សៀវភៅដៃបន្សុតប្រូតេអ៊ីនបោះពុម្ពផ្សាយ AB ។ ក្រុមហ៊ុន Amersham Pharmacia Biotech Inc. រដ្ឋ New Jersey, សហរដ្ឋអាមេរិក។ http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf ។