ការរៀបចំ DNA ជាពឹងផ្អែកលើសមត្ថភាពរបស់យើងក្នុងការប្រើ អេឡិចត្រូម៉ាញ៉េស្យា ដើម្បីបំបែក DNA នៃ DNA ដែលមានកម្រិតខុសគ្នាតិចតួច។
បំបែក DNA
នៅចុងទសវត្សរ៍ឆ្នាំ 1970 បច្ចេកទេសលំដាប់ DNA ជាច្រើនសម្រាប់ម៉ូលេគុល DNA វែងត្រូវបានបង្កើត។ ទាំងនេះគឺជាវិធីសាស្ត្រ Sanger (ឬ dideoxy) និងវិធីសាស្រ្ត ការបំផ្លាញ គីមី ( Maxam-Gilbert ) ។ វិធីសាស្រ្ត Maxam -Gillbert គឺផ្អែកលើការបំបែកដោយជាក់លាក់នៃនុយក្លេអ៊ែរដោយសារធាតុគីមីហើយត្រូវបានគេប្រើយ៉ាងល្អបំផុតក្នុងការបែងចែកអ៊ីយ៉ុងអូតូតូតទីន (ប៉ូលីមឺន nucleotide ខ្លីដែលជាធម្មតាមានទំហំតូចជាង 50 គល់មូលដ្ឋាន) ។ វិធីសាស្ត្រ Sanger ត្រូវបានគេប្រើប្រាស់ជាទូទៅព្រោះវាត្រូវបានគេទទួលស្គាល់ថាមានបច្ចេកទេសងាយស្រួលប្រើហើយជាមួយនឹងការ រីកចំរើននៃ PCR និងស្វ័យប្រវត្តិកម្មនៃបច្ចេកទេសត្រូវបានអនុវត្តយ៉ាងងាយស្រួលទៅនឹង strands នៃ DNA ដែលរួមបញ្ចូលទាំងហ្សែនទាំងមូល។ បច្ចេកទេសនេះត្រូវបានផ្អែកលើការបញ្ចប់ខ្សែសង្វាក់ដោយ dideoxynucleotides ក្នុងកំឡុងពេលប្រតិកម្មពន្យារកំណើត PCR ។
វិធីសាស្ត្រ Sanger
នៅក្នុងវិធីសាស្រ្ត Sanger, strand DNA ដែលត្រូវបានវិភាគត្រូវបានប្រើជាគំរូមួយនិង DNA polymerase ត្រូវបានគេប្រើក្នុងប្រតិកម្ម PCR មួយដើម្បីបង្កើត strands ចែងដោយប្រើ primers ។
ល្បាយប្រតិកម្ម PCR ចំនួនបួនផ្សេងគ្នាត្រូវបានរៀបចំដែលនីមួយៗមានផ្ទុកនូវភាគរយជាក់លាក់នៃឌីអេនឌ័រអ៊ីនូស្យូតតេស្ដូទីត (ddNTP) ទៅជាផ្នែកមួយនៃសារធាតុនុយក្លេអ៊ែរចំនួនបួន (ATP, CTP, GTP ឬ TTP) ។ ការសំយោគនៃខ្សែអេឌីអិនថ្មីបន្តរហូតដល់អាណាឡូកមួយត្រូវបានដាក់បញ្ចូលនៅពេលដែលខ្សែត្រូវកាត់ខ្លីមុន។
ប្រតិកម្ម PCR នីមួយៗនឹងបញ្ចប់ដោយមានល្បាយនៃប្រវែងខុសៗគ្នានៃខ្សែអេឌីអិនទាំងអស់ដែលបញ្ចប់ដោយសារធាតុនុយក្លូតូតដែលត្រូវបានគេដាក់ស្លាកសញ្ញាសម្រាប់ប្រតិកម្មនោះ។ ការប្រើ អេឡិចត្រូម៉ាញ៉េស្យូម ត្រូវបានគេប្រើដើម្បីញែកប្រតិកម្មនៃប្រតិកម្មចំនួនបួននៅក្នុងគន្លងបួនដាច់ដោយឡែកពីគ្នានិងកំណត់លំដាប់នៃគំរូដើមដោយផ្អែកលើប្រវែងនៃសរសៃឈាមដែលបញ្ចប់ដោយអ្វីដែលនុយក្លេអ៊ែរ។
នៅក្នុងប្រតិកម្មនុយក្លេអ៊ែរស្វ័យប្រវត្តិ, primers ត្រូវបានប្រើដែលត្រូវបានដាក់ស្លាកដោយស្លាកពណ៌ fluorescent ពណ៌បួនផ្សេងគ្នា។ ប្រតិកម្ម PCR, នៅក្នុងវត្តមាននៃ dideoxy nucleotides ផ្សេងគ្នា, ត្រូវបានអនុវត្តដូចដែលបានរៀបរាប់ខាងលើ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយក្រោយមកល្បាយប្រតិកម្មទាំងបួនត្រូវបានបញ្ចូលគ្នាហើយបានអនុវត្តទៅតាមផ្លូវតែមួយនៃជែល។ ពណ៌នៃបំណែកនីមួយៗត្រូវបានរកឃើញដោយប្រើធ្នឹមឡាស៊ែរហើយព័ត៌មានត្រូវបានប្រមូលដោយកុំព្យូទ័រដែលបង្កើតក្រាមីក្រូក្រាមដែលបង្ហាញពីកំពូលសម្រាប់ពណ៌និមួយៗដែលអាចរកឃើញអារេ DNA ។
ជាធម្មតាវិធីសាស្រ្តលំដាប់ដោយស្វ័យប្រវត្តិគឺមានភាពត្រឹមត្រូវតែសម្រាប់លំដាប់រហូតដល់អតិបរមាប្រហែល 700-800 គូ - ប្រវែង។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយវាអាចទទួលបាននូវហ្សែនធំ ៗ និងតាមហ្សែនទាំងមូលដោយប្រើវិធីសាស្ដ្រដែលមានភាពវៃឆ្លាតដូចជាការណែនាំដំបូងនិងការបាញ់ Shotgun ។
នៅក្នុងការ ដើរបឋម ដែលជាផ្នែកមួយដែលអាចធ្វើបាននៃហ្សែនធំត្រូវបានរៀបតាមលំដាប់ដោយប្រើវិធីសាស្រ្ត Sanger ។ primers ថ្មីត្រូវបានបង្កើតចេញពីចម្រៀកអាចទុកចិត្តបាននៃលំដាប់និងត្រូវបានប្រើដើម្បីបន្តលំដាប់នៃផ្នែកហ្សែនដែលមាននៅក្នុងជួរនៃប្រតិកម្មដើម។
ការរៀបចំជាបន្តបន្ទាប់ដោយ Shotgun កាត់បន្ថយផ្នែក DNA នៃចំណាប់អារម្មណ៍ចូលទៅក្នុងបំណែកទំហំសមស្រប (អាចគ្រប់គ្រងបាន) សមាសភាគបំណែកនិមួយៗនិងរៀបចំបំណែកដោយផ្អែកលើលំដាប់ត្រួតគ្នា។ បច្ចេកទេសនេះត្រូវបានធ្វើឱ្យកាន់តែងាយស្រួលដោយការប្រើកម្មវិធីកុំព្យួទ័រសម្រាប់ការរៀបចំបំណែកត្រួតគ្នា។