អ្វីដែល PCR ត្រូវធ្វើជាមួយនឹងការស្ទង់ DNA និងធ្វើឱ្យហ្សែនពង្រីក
ប្រតិកម្មខ្សែសង្វាក់ Polymerase ( PCR ) គឺជាបច្ចេកទេសហ្សែនម៉ូលេគុលមួយសម្រាប់បង្កើតច្បាប់ចម្លងហ្សែនជាច្រើនហើយក៏ជាផ្នែកមួយនៃដំណើរការហ្សែន។
តើប្រតិកម្មបណ្តាញខ្សែប៉ូលីមែរហ្សីមឺរេសមានដំណើរការយ៉ាងដូចម្តេច?
ច្បាប់ចម្លងហ្សែនត្រូវបានធ្វើឡើងដោយប្រើគំរូ DNA ហើយបច្ចេកវិទ្យានេះល្អគ្រប់គ្រាន់ដើម្បីបង្កើតច្បាប់ចម្លងច្រើនពីហ្សែនតែមួយនៃហ្សែនដែលរកឃើញក្នុងគំរូ។ PCR ពង្រីកហ្សែនដើម្បីបង្កើតច្បាប់ចម្លងរាប់លានអនុញ្ញាតឱ្យមានការរកឃើញនិងកំណត់អត្តសញ្ញាណហ្សែនហ្សែនដោយប្រើបច្ចេកទេសចក្ខុវិស័យដោយផ្អែកលើទំហំនិងការគិត (+ ឬ -) នៃបំណែក DNA ។
នៅក្រោមលក្ខខណ្ឌគ្រប់គ្រងផ្នែកតូចមួយនៃ DNA ត្រូវបានបង្កើតដោយអង់ស៊ីមដែលគេស្គាល់ថាជា DNA polymerases ដែលបន្ថែម deoxynucleotides (dNTPs) ទៅឌីអិនអេមួយដែលត្រូវបានគេស្គាល់ថាជាគំរូ។ សូម្បីតែបំណែកឌីអេនអេតូចៗដែលហៅថា "primers" ត្រូវបានគេប្រើជាចំណុចចាប់ផ្តើមសម្រាប់ប៉ូលីមេរ៉ាស។ គ្រាប់កាំភ្លើងគឺជាបំណែកឌីអេនអេ (man-made) របស់មនុស្សតូចៗ (oligomers) ដែលជាធម្មតាមានចន្លោះពី 15 ទៅ 30 nucleotides ។ ពួកវាត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយការដឹងឬទាយថាដំណាក់កាល DNA ខ្លីនៅចុងបញ្ចប់នៃហ្សែនត្រូវបានពង្រីក។ ក្នុងអំឡុងពេល PCR អេឌីអិនត្រូវបានតំរែតំរង់និងកំដៅទ្វេរដាច់ដោយឡែក។ នៅពេលត្រជាក់វត្ថុរាវនឹងភ្ជាប់ទៅនឹងគំរូ (ហៅថាការស្រង់) ហើយបង្កើតកន្លែងមួយសម្រាប់វត្ថុធាតុ polymerase ដើម្បីចាប់ផ្តើម។
បច្ចេកទេស PCR
ប្រតិកម្មសង្វាក់ Polymerase (PCR) ត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយការរកឃើញអង់ស៊ីម thermophiles និង thermophilic polymerase (អង់ស៊ីមដែលរក្សារចនាសម្ព័ន្ធនិងមុខងារបន្ទាប់ពីកំដៅនៅសីតុណ្ហភាពខ្ពស់) ។
ជំហានដែលពាក់ព័ន្ធនឹងបច្ចេកទេស PCR មានដូចខាងក្រោម:
- ល្បាយមួយត្រូវបានបង្កើតឡើងជាមួយនឹងការប្រមូលផ្តុំនៃគំរូឌីអិនអេ, អង់ស៊ីមប៉ូលីមឺរឺរ, មេជើរនិង dNTPs ។ សមត្ថភាពក្នុងការបណ្ដេញល្បាយដោយគ្មានអង់ស៊ីមបានបញ្ជាក់ថាអាចបែងចែកឧស្ម័នអេឡិចត្រូនិចពីរដងនៅសីតុណ្ហភាពក្នុងចន្លោះ 94 អង្សាសេ។
- បន្ទាប់ពីការបែកខ្ចាត់ខ្ចាយគំរូត្រូវបានធ្វើឱ្យត្រជាក់ដល់កម្រិតមធ្យមមួយនៅជុំវិញប្រហែល 54 អង្សាសេដែលជួយសម្រិតសម្រាំងនៃ primer ទៅគំរូ ADN តែមួយ។
- នៅដំណាក់កាលទីបីនៃវដ្តសំណាកនេះត្រូវបាន reheated ទៅ 72 ដឺក្រេដែលជាសីតុណ្ហភាពដ៏ល្អបំផុតសម្រាប់ Taq DNA Polymerase សម្រាប់ការពន្លូត។ ក្នុងអំឡុងពេលពន្លូត DNA polymerase ប្រើ DNA តែមួយ strand នៃ ADN ជាគំរូដើម្បីបន្ថែម dNTPs បន្ថែមទៅចុង 3 'នៃ primer នីមួយៗនិងបង្កើតផ្នែកមួយនៃ ADN ទ្វេដងក្នុងតំបន់នៃហ្សែននៃការប្រាក់។
- បឋមដែលបានធ្វើការប្រមូលផ្ដុំទៅនឹងជ។ ស។ ដ។ ដែលមិនមែនជាការផ្គូរផ្គងពិតប្រាកដនោះមិនត្រូវបានប្រមូលផ្តុំនៅ 72 អង្សារទេដូច្នេះការកំណត់ការពន្លូតទៅហ្សែននៃចំណាប់អារម្មណ៍។
ដំណើរការនៃការបែងចែកការរីងស្ងួតនិងពន្លូតត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតច្រើន (30-40) ដងដោយបង្កើនចំនួនចំលងហ្សែនដែលចង់បាននៅក្នុងល្បាយ។ ទោះបីជាដំណើរការនេះអាចធុញទ្រាន់យ៉ាងណាក៏ដោយបើសិនជាបានអនុវត្តដោយខ្លួនឯងក៏ដោយក៏សំណាកអាចត្រូវបានគេរៀបចំនិងដាក់បញ្ចូលក្នុងកំព្យូទ័រ Thermocycler ដែលបច្ចុប្បន្នជាធម្មតានៅក្នុងមន្ទីរពិសោធន៍ម៉ូលេគុលភាគច្រើនហើយប្រតិកម្ម PCR ពេញលេញអាចត្រូវបានអនុវត្តក្នុងរយៈពេល 3-4 ម៉ោង។
ជំហានបំបែកខ្លួននីមួយៗបញ្ឈប់ដំណើរការវឌ្ឍនភាពនៃវដ្តមុនដូច្នេះកាត់បន្ថយខ្សែក្រវ៉ាត់ DNA ថ្មីនិងរក្សាវាឱ្យជិតប្រហែលទំហំហ្សែនដែលចង់បាន។
រយៈពេលនៃការវះកាត់អាចត្រូវបានធ្វើឱ្យវែងឬខ្លីអាស្រ័យលើទំហំនៃហ្សែននៃការចាប់អារម្មណ៍ប៉ុន្តែជាចុងក្រោយតាមរយៈវដ្តម្តងហើយម្តងទៀតនៃគំរូ PCR ភាគច្រើននៃគំរូនឹងត្រូវបានកំនត់ចំពោះទំហំនៃហ្សែននៃការប្រាក់តែម្នាក់ឯង។ នឹងត្រូវបានបង្កើតឡើងពីផលិតផលទាំងពីរនៃ primers ។
មាន កត្តា ផ្សេងៗគ្នា ជាច្រើនសម្រាប់ PCR ដែល ទទួលបានជោគជ័យ ដែលអាចត្រូវបានរៀបចំដើម្បីបង្កើនលទ្ធផល។ វិធីសាស្រ្តដែលត្រូវបានគេប្រើយ៉ាងទូលំទូលាយដើម្បីធ្វើតេស្តសម្រាប់វត្តមាននៃផលិតផល PCR គឺ អេឡិចត្រូម៉ាញ៉េស្យូហ្សែល ។ ដែលត្រូវបានប្រើដើម្បីបំបែកបំណែក DNA ដោយផ្អែកលើទំហំនិងការចោទប្រកាន់។ បំណែកបន្ទាប់មកត្រូវបានមើលឃើញដោយប្រើថ្នាំពណ៌ឬវិទ្យុសកម្ម។
Evolution
ចាប់តាំងពីការរកឃើញនៃ PCR, DNA polymerases ផ្សេងទៀតជាង Taq ដើមត្រូវបានគេរកឃើញ។ មួយចំនួននៃទាំងនេះមានសមត្ថភាព "ពិនិត្យឡើងវិញ" ប្រសើរជាងមុនឬមានស្ថេរភាពនៅសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ដូច្នេះធ្វើអោយប្រសើរឡើងនូវភាពជាក់លាក់នៃ PCR និងកាត់បន្ថយកំហុសពីការបញ្ចូលនៃ dNTP មិនត្រឹមត្រូវ។
ការប្រែប្រួលមួយចំនួននៃ PCR ត្រូវបានគេបង្កើតឡើងសម្រាប់កម្មវិធីជាក់លាក់ហើយឥឡូវនេះត្រូវបានគេប្រើយ៉ាងទៀងទាត់នៅក្នុងមន្ទីរពិសោធន៍ហ្សែនម៉ូលេគុល។ មួយចំនួននៃការទាំងនេះគឺជាពេលវេលាពិត PCR និងបញ្ច្រាស -transcriptase PCR ។ របកគំហើញនៃ PCR ក៏បាននាំឱ្យមានការអភិវឌ្ឍ DNA sequencing, DNA fingerprinting និងបច្ចេកទេសម៉ូលេគុលផ្សេងទៀត។